Genetika zohráva v diagnostike hematologických ochorení často veľmi dôležitú – miestami až nevyhnutnú – úlohu. Kým niektoré hematologické ochorenia nemajú prítomný špecifický genetický marker, pri vybraných onkologicko-hematologických diagnózach je postavenie genetiky nesporné. A to nielen v iniciálnej fáze stanovenia diagnózy, ale aj v prognózovaní samotného priebehu ochorenia, monitoringu liečebnej odpovede, či v sledovaní tzv. minimálnej reziduálnej choroby (MRD). Význam genetiky vieme najlepšie priblížiť práve na príklade konkrétnych frekventovaných onkologicko-hematologických ochorení, a to chronickej myeloidnej leukémie (CML) a chronickej lymfocytovej leukémie (CLL).

Chronická myleoidná leukémia

Odborné medzinárodné skupiny – European leukemia Net (ELN) a National Comprehensive Cancer Network (NCCN) – vypracovali medzinárodne akceptované odporúčania v liečbe, ale aj monitoringu CML pacientov, ktoré sú založené práve na genetickom vyšetrení. Na základe aktuálnej liečby tyrozínkinázovými inhibítormi (TKI) a potreby stanovenia jednoznačných kritérií pre definovanie 3 skupín liečebnej odpovede (optimálna, suboptimálna a nepostačujúca) bol za zlatý štandard – míľnik v hodnotení liečebnej odpovede – stanovený moment dosiahnutia kompletnej cytogenetickej odpovede (CcyR) definovanej práve na základe genetického vyšetrenia. Dosiahnutie CCyR v jednotlivých časových bodoch má podľa viacerých štúdií priamy dopad na prežívanie do progresie (PFS), ako aj celkové prežívanie (OS).

V iniciálnej fáze vstupného genetického vyšetrenia je často dôležité vyšetriť viaceré materiály a to platí aj v prípade ochorenia CML. Vstupné vyšetrenie u pacienta s podozrením na CML sa realizuje z kostnej drene, ale aj z periférnej krvi. Pod pojmom genetické vyšetrenie môžeme často vidieť viaceré výstupy pochádzajúce z rôznych typov použitých genetických metód. Napríklad iniciálne genetické vyšetrenie CML je realizované pomocou vhodnej kombinácie až troch vyšetrovacích metód:

• metódou klasickej cytogenetiky (CGV),
• metódou molekulovej cytogenetiky (FISH),
• metódou molekulovej analýzy pomocou real time PCR a nested PCR.

V prípade CML je voľba vyšetrovacích metód podmienená viacerými faktormi.

Vyšetrenie metódou klasickej cytogenetiky (CGV)

Vyšetrenie metódou klasickej cytogenetiky je dôležité na posúdenie prítomnosti Ph chromozómu (Obrázok č. 2), ale aj prípadných prídavných chromozómových aberácií (-Y, +8, -7 a iné – Obrázok č. 1). Práve prídavné chromozómové aberácie v úvode môžu poukazovať na predpoklad blastovej alebo akcelerovanej fázy ochorenia. Približne 60 – 80 % pacientov s CML v blastovej kríze má prítomné prídavné genetické aberácie.

Druhou významnou úlohou vyšetrenia metódou klasickej cytogenetiky je možnosť detegovania atypickej CML (aCML). Atypická CML je charakterizovaná neprítomnosťou Ph chromozómu, ako aj neprítomnou translokáciou BCR/ABL. Z klinických znakov je prítomná leukocytóza, ako aj dysplázia myeloidnej rady. Medzi pomerne časté chromozómové aberácie aCML, ktoré môžeme nájsť prostredníctvom CGV, patria delécie lokusov 5q, 13q, 17p.

Podľa WHO klasifikácie vykazuje aCML myeloproliferatívne, ako aj myelodysplastické znaky. Práve na základe prítomnosti leukocytózy sa dostáva do diferenciálnej diagnostiky s klasickou Ph+ CML. Hlavným znakom, ktorý ich odlíši, je opäť samotné genetické vyšetrenie a neprítomnosť Ph chromozómu. Práve tieto skutočnosti podčiarkujú nezameniteľný význam klasickej cytogenetickej analýzy v porovnaní s cieleným vyšetrením pomocou lokus špecifických sond BCR/ABL – metódou molekulovej cytogenetiky FISH.

Pri samotnom genetickom vyšetrení zohráva významnú úlohu typ vyšetrovaného materiálu. Vyšetrovaným materiálom pri CGV u pacientov s CML je kostná dreň. Aby sme získali hodnotiteľné objekty – tzn. metafázy – musíme kostnú dreň pred vyšetrením kultivovať 24 hodín v kultivačnom médiu a neskôr zafarbiť Wrightovým farbivom (tzv. G-banding). Štandardne hodnotíme 20 metafáz. V prípade malého množstva metafáz alebo neprítomnosti mitotickej aktivity považujeme výsledok vyšetrenia CGV za málo informatívny, respektíve neinformatívny.

Výhody vyšetrenia metódou CGV:

• komplexný pohľad na karyotyp kostnej drene,
• detekcia prídavných zmien (akcelerovaná, blastová fáza),
• detekcia atypickej CML.

Nevýhody vyšetrenia metódou CGV:

• neprítomnosť mitotickej aktivity – BMA/málo hodnotiteľných metafáz (najčastejšie v dôsledku nedodržania zásad predanalytickej fázy genetického vyšetrenia),
• v prípade prítomnosti kryptickej translokácie treba overiť prítomnosť BCR/ABL translokácie metódou FISH,
• nutnosť hodnotenia skúseným cytogenetikom,
• v prípade kompozitného karyotypu – náročnosť stanovenia klonového vývinu.

Vyšetrenie metódou molekulovej cytogenetiky FISH

Ďalší typ potrebného vyšetrenia u pacientov s CML predstavuje vyšetrenie metódou molekulovej cytogenetiky – FISH. V iniciálnej fáze toto vyšetrenie (z kostnej drene) umožňuje konfirmáciu pozitívneho nálezu klasickej cytogenetiky, ale aj možnosť potvrdenia CML v prípade zriedkavej kryptickej translokácie. 

Vieme, že pokiaľ je u pacienta s CML prítomná raritná kryptická translokácia, tak sa metódou CGV nezobrazí. U pacienta s kryptickou translokáciou CML môžeme vidieť normálny karyotyp s celkovým počtom 46 chromozómov XX alebo XY, v závislosti od pohlavia pacienta, ale bez prítomnosti Ph chromozómu! Cielené FISH vyšetrenie umožňuje odhaliť prítomnosť kryptickej translokácie t(9;22)(q11,q34), ktorá by inak metódou CGV nebola detegovaná.

Štandardný počet vyšetrovaných interfázových jadier je 200. Senzitivita metódy je podmienená aj šedou zónou, v závislosti od použitej lokus špecifickej sondy. Mnohí výrobcovia a mnohé laboratóriá definujú cut off level – hranicu falošnej pozitivity pre BCR/ABL sondu – v rozmedzí od 1 – 5 % BRC/ABL pozitívnych interfázových jadier. Práve tieto fakty môžu spôsobovať interpretačné rozpaky vo vzťahu k definovaniu kompletnej cytogenetickej remisie metódou interfázovej FISH.

Výhody vyšetrenia metódou FISH:

• detekcia BRC/ABL fúzie v prípade CML s kryptickou translokáciou bez viditeľného Ph chromozómu na úrovni klasickej cytogenetiky,
• určenie presného typu translokácie (jednoduchá, variantná, komplexná),
• detekcia prídavného Ph+,
• presná kvantifikácia – percentuálne stanovenie patologického klonu,
• vysoká špecificita a senzitivita,
• stálosť interfázových jadier – minimum nehodnotiteľných preparátov metódou FISH v prípade CML.

Nevýhody vyšetrenia metódou FISH:

• zložitosť interpretácie hraničných hodnôt,
• finančná náročnosť,
• nutnosť hodnotenia skúseným cytogenetikom.

Vyšetrenie metódou molekulovej analýzy pomocou real time PCR a nested PCR

Iniciálne sa na molekulovej úrovni kombinuje vyšetrenie pomocou real time PCR a nested PCR, neskôr – v priebehu monitoringu – sa pre potreby kvantifikácie a sledovania MMR používa vyhodnocovanie pomocou kvantitatívnej PCR (Q PCR). Senzitivita použitej metodiky real time PCR predstavuje 10-4, senzitivita Q PCR predstavuje 10-4 a senzitivita nested PCR 10-6.

Kombinácia metódy real time PCR a nested PCR má viacero významov. Umožňuje presné stanovenie variantu miesta scelenia, ale aj možnosť detegovania raritných produktov fúzneho génu BCR/ABL. Najčastejším produktom fúzneho génu BCR/ABL pri CML je proteín BCR/ABL p210. Vo výnimočných prípadoch sa aj u CML pacientov môže vyskytnúť produkt BCR/ABL l p190, BCR/ABL p195 alebo BCR/ABL p200, popisovaný najmä v súvislosti s ALL Ph+. Ojedinelý, ale nie vylúčený je pri CML aj produkt nadmernej veľkosti BCR/ABL p225 alebo BCR/ABL p230.

Najčastejšie sa vyskytujúce varianty miesta scelenia produktu BCR/ABL p210 sú BCR3/ABL2. Menej častý je variant BCR2/ABL2. Veľmi zriedkavo sa môže objaviť variant BCR3/ABL3 a variant BCR2/ABL3, ktorý nie je detekovateľný prostredníctvom real time PCR. 

Práve raritné varianty miesta scelenia pri klasickom a najčastejšom produkte BCR/ABL p210 alebo veľké produkty p225, p230 odôvodňujú význam paralelnej molekulovej analýzy pomocou real time PCR a nested PCR.

Význam vstupného vyšetrenia pomocou real time PCR a nested PCR:

• detekcia presného variantu miesta scelenia v prípade produktu p210 (BCR3/ABL2; BCR2/ABL2; BCR3/ABL3; BCR2/ABL3),
• špecifikácia veľkosti fúzneho produktu (p190 – p230),
• stanovenie množstva fúzneho transkriptu a stanovenie vzorky dx- z času diagnózy, ku ktorej sa realizuje kvantifikácia v priebehu monitoringu molekulovej odpovede.

Výhody vyšetrenia metódou DNA/RNA analýzy:

• vyšetrovaný materiál v priebehu monitoringu ochorenia CML – periférna krv, 
• špecificita,
• senzitivita,
• presná kvantifikácia.

Nevýhody vyšetrenia metódou DNA/RNA analýzy:

• pri kontaminácii vzorky – nemožnosť vyšetrenia,
• dostatočný počet molekúl kontrolného génu pri kvantifikácii,
• skúsený vysokoškolský pracovník.

Genetický monitoring cytogenetickej remisie v priebehu liečby TKI pri CML

Cytogenetická remisia (CyR) je odstupňovaná podľa počtu Ph+ metafáz vyjadrených v percentách.

Cytogenetická odpoveď je považovaná za „zlatý štandard“ hodnotenia liečebnej odpovede. Pre stanovenie CyR je optimálne vyšetrenie metódou klasickej cytogenetiky zo vzorky kostnej drene (štandardný počet 20 metafáz). Rozlišujeme 5 stupňov cytogenetickej odpovede. V literatúre sa môžeme stretnúť aj s pojmom veľká cytogenetická odpoveď (MCyR). MCyR zahŕňa prítomnosť parciálnej aj kompletnej cytogenetickej odpovede.

V prípade prítomnosti menšieho počtu než 20 hodnotiteľných metafáz alebo neprítomného materiálu kostnej drene, môžeme definovať a hodnotiť cytogenetickú remisiu prostredníctvom molekulovej cytogenetiky FISH. Jej už spomínanou nevýhodou je mimo sťaženej interpretácie (v prípade hraničnej pozitivity BCR/ABL interfáz) aj nemožnosť detekcie iných prídavných chromozómových aberácií.

Dosiahnutie kompletnej cytogenetickej odpovede v jednotlivých časových bodoch (6. mesiac, 12. mesiac) je dôležitým faktorom predpokladu prežívania do progresie ochorenia – PFS aj celkového prežívania – OS. 

Využitie jednotlivo opísaných genetických metód sa v priebehu liečby u pacienta s diagnózou CML mení. Prehľad genetických vyšetrení v priebehu monitoringu liečby TKI je nasledovný:

• 0. mesiac liečby, v čase stanovenia dg.: CGV (KD), FISH (KD), DNA/RNA analýza a nested PCR (PK),
• 3. mesiac: CGV (KD), ak menej než 20 metafáz, alebo je prítomný len materiál PK – FISH, Q PCR (PK),
• 6. mesiac: CGV (KD), ak menej než 20 metafáz – FISH (KD), Q PCR (PK),
• 12. mesiac – CGV (KD), ak menej než 20 metafáz – FISH (KD), Q PCR (PK),
• 18. mesiac – CGV (KD), ak menej než 20 metafáz – FISH (KD), Q PCR (PK),
• v prípade dosiahnutia kompletnej cytogenetickej odpovede sledovanie prostredníctvom Q PCR, nested PCR (PK),
• všetci pacienti s kompletnou cytogenetickou odpoveďou aj s molekulovou odpoveďou (MR) ročné sledovanie metódou CGV (KD) (približne 5 % pacientov má prídavné chromozómové aberácie), kvalitatívnou real time PCR (PK) a nested PCR (PK),
• u pacientov s dosiahnutou kompletnou cytogenetickou remisiou ochorenia CML zohráva naďalej dôležitú úlohu genetický monitoring molekulovej odpovede a sledovanie samotnej hĺbky molekulovej odpovede,
• metóda RQ PCR nám umožňuje senzitívne monitorovanie minimálneho reziduálneho ochorenia; sledovanie priebehu ochorenia (MRD) na molekulárnej úrovni sa hodnotí ako racio BCR-ABL/ABL * CF (%); dôležitým bodom pre liečebnú odpoveď je dosiahnutie MMR čo v IS predstavuje 0,1 % (pokles o 3 log); definovanie MMR významne závisí od kvality vzorky a citlivosti použitej metodiky.

Význam genetiky je v stanovení dg. CML, jej monitoringu a v sledovaní MRD nenahraditeľný. Práve výstupy genetických vyšetrení umožňujú lekárovi optimálne personalizovať liečbu CML pacientov, ako aj zlepšovať kvalitu ich života.

Význam genetiky má v diagnostike a monitoringu hematoonkologických ochorení svoje pevné miesto. Úloha genetiky je vo vysokej miere asociovaná s možnosťou prognózovania ochorenia v závislosti od výskytu špecifických genetických aberácií. Inak tomu nie je ani v prípade chronickej lymfocytovej leukémie. Aktuálny a vcelku ucelený koncept prognostických faktorov chronickej lymfocytovej leukémie prešiel svojím vývojom. Približne 40 – 50 % prípadov chronickej lymfocytovej leukémie je charakterizovaných prítomnosťou cytogenetickej aberácie. U pacientov s abnormálnym karyotypom je v 65 % prípadov detegovaná izolovaná chromozómová aberácia, v 25 % prípadov sa nachádzajú 2 abnormality súčasne a len približne 10 % prípadov má komplexné zmeny karyotypu. 

Medzi v praxi etablované genetické prognostické markery patrí nález delécie v oblasti 17p13 (gén TP53), delécie v oblasti 11q22-23 (gén ATM), delécie lokusu 13q14 a nález trizómie chromozómu 12. Tieto markery ochorenia sú najčastejšie vyšetrované metódou molekulovej cytogenetiky FISH. Vyšetrovaným materiálom je periférna krv a štandardne je zhodnotených opäť 200 interfázových jadier.

Delécia oblasti 13q14 patrí do skupiny prognosticky priaznivých chromozómových aberácií a zároveň predstavuje najčastejšie sa vyskytujúcu chromozómovú aberáciu pri CLL (40 – 65 %). Priaznivý charakter delécie sa stráca v prítomnosti ďalšej chromozómovej aberácie. Obdobne je kvantifikácia patologického klonu spájaná s predpokladom priaznivej (klon pod 80 interfázových jadier) versus nepriaznivej prognózy (klon nad 80 % interfázových jadier) pri nálezoch delécií lokusu 13q14. Treťou najčastejšie sa vyskytujúcou chromozómovou aberáciou pri B-CLL je trizómia chromozómu 12. Vyskytuje sa v 15 – 20 % prípadov a z toho v 60 % ako izolovaná aberácia bez prídavných genetických alterácií. Trizómia 12 v mnohých štúdiách signifikantne koreluje s atypickou morfológiou pri B-CLL.

Do skupiny prognosticky nepriaznivých chromozómových aberácií patrí delécia génu ATM. Približne 10 – 20 % CLL pacientov má leukemické bunky s deléciou na dlhom ramienku chromozómu 11. Poškodená funkcia ATM spôsobuje dereguláciu bunkového cyklu a vedie k akumulácii malígnych B-buniek, ktoré sú náchylnejšie na vznik prídavných genetických aberácií. Rovnako je pri delécii génu ATM je popisovaný agresívnejší priebeh, lymfadenopatia, jej výskyt je prednostne u mladších pacientov. 

V regióne 11q22-23 je niekoľko zaujímavých kandidátnych génov ako napríklad ATM, FDX, MLL a RDX, ktoré bývajú spájané mnohými inými lymfoproliferatívnymi ochoreniami. U CLL je najčastejšie popisovaný gén ATM (ataxia-teleangiectasia mutated). 

Mutačný status IgVH

Jedným z nezávislých prognostických markerov chronickej lymfocytovej leukémie, ktorý počas ochorenia zostáva stabilný, je mutačný stav génov kódujúcich variabilné oblasti génov pre ľahké reťazce imunoglobulínov – tzv. IgVH status.

Štúdie expresie IgVH génových segmentov na podklade prezencie alebo absencie somatických mutácií poukázali na dva typy CLL. Približne 40 – 50 % pacientov produkuje leukemické klony, ktorých expresia imunoglobulínových regiónov je odlišná od zárodočnej línie vo viac než 2 % vo V segmente ťažkého imunoglobulínového reťazca. Takáto individualita – odlišnosť od zárodočnej línie – predstavuje pre pacienta priaznivú prognózu ochorenia a je hodnotená ako pozitívny mutačný status. Naopak, ≤ 98-percentná homológia IgVH je nepriaznivým prognostickým markerom ochorenia s mediánom prežívania pacientov 8 – 10 rokov. 98-percentná sekvenčná homológia predstavuje klinický „cut-off“ medzi dobrou (mutovaný status) a zlou (nemutovaný status) prognózou. Analýza IgVH segmentov preukázala prednostný výskyt špecifických VH segmentov v závislosti od mutačného statusu CLL. U nemutovaných CLL sa prednostne vyskytuje segment VH1-69 IgH génu, na rozdiel od prípadov s pozitívnym mutačným statusom, kde sa vyskytuje segment VH3-21, ktorý má zlú prognózu. Avšak prítomnosť segmentu VH3-21 je asociovaná so zlou prognózou ochorenia nezávisle od výsledku mutačného statusu. 

TP53

Pri potvrdení nálezu delécie génu TP53 metódou molekulovej cytogenetiky FISH je dôležitá aj kvantifikácia patologického klonu. Podľa multivariantných analýz je nález klonu s deléciou génu TP53 pod 25 % interfázových jadier spájaný s priaznivejšou prognózou (3-ročné prežívanie, 92 % pacientov). U pacientov s deléciou génu TP53 v rozmedzí od 25 – 74 % interfázových jadier je popisovaná intermediárna prognóza (3-ročné prežívanie, 67 % pacientov) a najmenej priaznivé vyhliadky sú u pacientov s deléciou TP53 nad 74 % (3-ročné prežívanie, 40 % pacientov; P – 0,01). Na druhej strane, nález izolovanej delécie génu TP53 versus delécie génu TP53 s inými abnormalitami súčasne (komplexný karyotyp) nevedie k iným časom v progresii ochorenia alebo k rozdielu v celkovom prežívaní.

TP53 je tumor supresorový gén lokalizovaný na krátkom ramienku chromozómu 17 oblasti 17p13. Gén pokrýva 20kb s nekódujúcim prvým exónom a veľmi dlhým prvým intrónom – 10kb. Tento gén kóduje p53 proteín, ktorý je zložený z 393 aminokyselín a je tvorený štyrmi hlavnými doménami: transkripčne aktívna doména (N-koniec), DNA-väzobná doména (centrálna časť), oligomerizačná doména (C-koniec) a regulačná doména (C-koniec) (Obrázok č. 5).

Na molekulárnej úrovni je v čase stanovenia diagnózy dôležité sledovať mutačný status TP53 génu, ktorý sa môže, ale aj nemusí vyskytovať súčasne s deléciou génu TP53 (detegovaná metódou FISH). Keďže sa mutácie génu TP53 môžu vyskytnúť aj v čase liečby, je dôležité ich vyšetriť aj pri progresii ochorenia, prípadne pri plánovanej zmene liečby. Približne 80 – 90 % všetkých mutácií génu je sústredených v DNA-väzobnej doméne. Tieto mutácie významne zvyšujú nádorový potenciál buniek pre neschopnosť p53 viazať sa na cieľovú DNA. 

Približne 75 % všetkých mutácií predstavujú tzv. missense mutácie, pri ktorých dochádza k aminokyselinovej zámene. Značná časť mutácií je lokalizovaná v typických „hot spot“ oblastiach. Tieto mutácie potom priamo narúšajú p53-DNA interakciu (DNA-kontaktné mutácie – mutácie na aminokyselinových zvyškoch 248 a 273), alebo spôsobujú konformačnú zmenu (konformačné mutácie – mutácie na aminokyselinových zvyškoch 175, 245, 249 a 282). Veľká časť mutácií vedie k vážnym funkčným poruchám p53 proteínu, avšak nie všetky missense mutácie sprostredkovávajú úplnú stratu funkcie, niektoré z nich dokážu zachovať čiastočnú funkciu p53 proteínu. Niektoré mutácie môžu spôsobovať dominantne negatívny efekt na wild-type p53. Niektoré p53 mutácie môžu tiež spôsobovať vznik novej funkcie (gain of function), ktorá môže prispieť k rozvoju kancerogenézy. Experimentálne bolo dokázané, že mutácie s fenotypom – gain of function – sú prítomné práve pri ochorení CLL.

Strata funkcie TP53

Prítomnosť aberácií génu TP53 vedie u B-CLL pacientov k agresívnejšiemu priebehu ochorenia a k rezistencii na terapiu. Gén TP53 býva vo väčšine prípadov inaktivovaný deléciou jednej alely a mutáciou na druhej alele, ale samozrejme sa tiež vyskytujú samostatné delécie či mutácie bez poškodenia druhej alely. Použitím vhodných metód je v súčasnosti možné detegovať prítomnosť aberácií v géne TP53, ktoré nám umožnia zaradiť pacienta do „ultra high-risk“ CLL skupiny a zaujať k nemu správny postoj, čo sa týka liečby a progresie ochorenia. U každého pacienta je potrebné stanoviť mutačný status TP53 hneď v iniciálnej fáze ochorenia ešte pred podaním terapie a v prípade prítomnosti mutácie ju treba počas liečby sledovať. V prípade, že u pacienta nebola identifikovaná mutácia iniciálne, mal by byť opakovane vyšetrený mutačný status TP53 až pred podávaním terapie, prípadne pri zmene terapie.

Záver

Na príkladoch ochorení CML a CLL sme mohli vidieť samotný význam genetického vyšetrenia a jeho pevné miesto v každodennej praxi. Sledovanie ochorenia pomocou viacerých vybraných metód a ich kombinácie ukazuje na širokú škálu možností genetickej diagnostiky a sledovanie prítomnosti konkrétnych aberácií aj na samotnú možnosť bližšieho prognózovania ochorenia, ako aj samotnej stratifikácie pacienta. Genetické vyšetrenia sa stali súčasťou komplexného diagnostického algoritmu a ich význam stále vzrastá.

---

Literatúra

1. Monoalelic and biallelic inactivation of TP53 gene in chronic lyphocytic leukemia: selection, impact on survival, and response to DNA damage. 2010.
2. May, P. and May, E. (1999). Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene, 18 (53), 7621 – 7636.
3. Ko, L. J. & Prives, C. (1996). p53: puzzle and paradigm. Genes Dev, 10 (9), 1054 – 1072.
4. Overholtzer, M., Rao, P. H., Favis, R., Lu, X. Y., Elowitz, M. B., Barany, F., Ladanyi, M., Gorlick, R. and Levine, A. J. (2003). The presence of p53 mutations in human osteosarcomas correlates with high levels of genomic instability. Proc Natl Acad Sci U S A, 100 (20), 11547 – 11552.
5. Gu, Y., Turck, C. W. and Morgan, D. O. (1993). Inhibition of CDK2 activity in vivo by an associated 20K regulatory subunit. Nature, 366 (6456), 707 – 710.
6. Momand, J., Zambetti, G. P., Olson, D. C., George, D. and Levine, A. J. (1992). The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell, 69 (7), 1237 – 1245.
7. Pospíšilová S., Gonzalez D., Malčíková J., Trbušek M., Rossi D., Kater AP., Cymbalista F., Eichhorst B., Hallek M., Döhner H., Hiilmen P., van Oers M., Gribben J., Ghia P., Montreserrat E., Stilgenbauer S. and Zenz T. (2012). ERIC recommendations on TP53 mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia (2012) 1 – 4.
8. Rosenwald, A., Alizadeh, A. A., Widhopf, G. et al. (2001). Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia.
   J Exp Med, 194(11):1639 – 47.